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1402年，朱棣发动靖难之役夺建文帝帝位，19年后迁都北平，将南京改为留都，设南京六部等机构。明代中叶，南京城人口达120万，成为当时世界上最大的首都。终明一朝，南京一直是南方乃至全国的政治、经济、文化中心。

1645年满清入关，攻陷南京后遂即废除国都地位，改应天府为江宁府，成为江南省省府。南京成为统辖江苏（含上海）、安徽和江西三省军民政务的两江总督驻地。在经济方面南京具有相当的重要性，清廷在南京设立规模庞大的江宁织造府，生产供应皇家需求的丝织品。

1842年鸦片战争战败后，清政府于1842年在南京下关江面英国军舰“康华丽”号上签订中国近代史上第一个不平等条约《南京条约》，拉开了中国近代史的帷幕。1853年，太平军攻克南京，建立太平天国，改称天京，建都11年。

1911年12月29日，起义的17省代表在南京选举孙中山为临时大总统，中华民国建立。1912年元旦，中华民国临时政府在南京成立，孙中山宣誓就任临时大总统。1927年3月24日，国民革命军北伐攻克南京。4月18日在成立南京国民政府，定南京为首都，同年置南京特别市。1930年改为院辖市（直辖市）。1927年至1937年的十年被称作“黄金十年”，期间南京进行大规模的首都建设，奠定了现代城市发展的良好基础。到1937年，南京的城市人口增加到100万以上，为中国六大城市之一。

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